フェロセン修飾DNAを利用した遺伝子センサー





 電気化学法は、安価で比較的高感度な分析手法である。狙った核酸を電気化学的に特異的にラベル化するためにDNA末端にフェロセンを化学修飾したDNAコンジュゲート(Fc-DNA)を合成した。特定遺伝子をFc-DNAでラベル化し、電気化学検出器を備えたHPLCで検出実験を行った結果、fmolレベルの高感度な検出が可能になることがわかった。

 また、同じ電気化学プローブ、Fc-DNAを利用して世界初の電気化学的遺伝子センサーを製作した(図)。標的遺伝子の一部に相補的な短いDNAを電極上に固定化する。この電極を浸している同じ溶液中にはFc-DNAを共存させている。電極固定化DNAFc-DNAは標的遺伝子の隣り合うサイトに相補的になるように設計している。すなわち、この系に標的遺伝子が添加されると、電極表面で標的遺伝子を挟んだサンドイッチ型のタンデム二本鎖が形成する。これによって、Fcユニットが電極表面に濃縮されるため、標的遺伝子の存在を電流変化として捉えることが可能であった。標的中の一塩基の変化に対しても鋭敏に応答することがわかったのでSNP解析への応用も可能である。

 フェロセンを基体とするアミダイト試薬を合成した。これを用いてフェロセン構造をDNAの(末端でなく)骨格中に組込んだ新しいタイプの電気化学活性DNAコンジュゲートを合成した。主鎖骨格に導入されたフェロセンはDNAの構造形成に伴って、その電位をシフトさせることがわかった。酸化電位は、フェロセンが二本鎖骨格中に存在する場合には、二本鎖形成に伴って負に、フェロセンがヘアピン型二本鎖のループ部分に存在する場合には逆に正にシフトすることがわかった。これは、構造形成にともなうフェロセン周辺のミクロ環境の変化で説明することができ、機能性核酸の高次構造解析のためのプローブとしての可能性を持つことが示された。



フェロセン-シクロデキストリン包接複合体形成を利用した均一溶液における電気化学バイオセンサー





 β-シクロデキストリン(β-CyD)修飾DNACyD-ODN)とフェロセン(Fc)修飾DNAFc-ODN)を合成し、これを利用した均一溶液中での核酸の電気化学的検出の可能性を検討した。CyD-ODNFc-ODNは互いの修飾部位を内側に向けてターゲットDNAに結合してタンデム二本鎖CyD-ODN/target/Fc-ODNを形成するように設計した。形成した二本鎖は、同配列の未修飾DNAに比べて熱的に著しく安定であり、このことは、タンデム二本鎖上でのβ-CyD/Fcの包接錯体形成を強く示唆していた。

 CyD-ODN/target/Fc-ODNの電気化学計測を行った結果、Fc-ODNの電気化学応答は二本鎖形成に伴って著しく抑制されることがわかった。系統的に塩基を置換したtargetを使用して、電気化学応答を計測した結果、Fcの酸化電流は完全相補のtargetについてのみ大きく減少した。バイオ分析において、消光分子を利用したFRET(蛍光共鳴エネルギー移動)がよく利用されているが、ここで得られた結果は、β-CyDが、電気化学法におけるFc消光分子としてはたらいているとみることができる。生体分子をターゲットとした電気化学センサーでは、相互作用する分子の片方を電極上に固定化する必要があった。ここで観察されたβ-CyD/Fcの可逆的相互作用を、対象とする検出系に適当なかたちで組込んでやることで、均一溶液中で電気化学的検出を行うことができる。

 高感度検出の可能性を検討するためにECD(電気化学検出器)を利用したフロー系で基礎的な計測を行った。HPLC-ECDを利用して検出実験を行った結果、数十pmolFc-ODNを容易に検出すれうことができた。また、フロー系においてもFcの酸化シグナルをCyD-ODN添加により定量的に消光することができた。